เพื่อกำหนดวิธีการมาตรฐานในการนับแบคทีเรียที่มีชีวิตอยู่ในตัวอย่างต่าง ๆ โดยแสดงผลเป็นหน่วยการสร้างอาณานิคม (CFU: Colony Forming Units) ด้วยวิธีการเจือจางแบบอนุกรมและการเพาะเชื้อบนจาน

Total Bacteria Colony Counting Service

1. วัตถุประสงค์

เพื่อกำหนดวิธีการมาตรฐานในการนับแบคทีเรียที่มีชีวิตอยู่ในตัวอย่างต่าง ๆ โดยแสดงผลเป็นหน่วยการสร้างอาณานิคม (CFU: Colony Forming Units) ด้วยวิธีการเจือจางแบบอนุกรมและการเพาะเชื้อบนจาน

2. ขอบเขต

ขั้นตอนนี้ใช้สำหรับตัวอย่างทุกชนิดที่ส่งเข้ามาทดสอบในห้องปฏิบัติการ เช่น ตัวอย่างน้ำ อาหาร หรือสิ่งแวดล้อม

3. ความรับผิดชอบ

• เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการ: ปฏิบัติตามขั้นตอนที่กำหนด ตรวจสอบให้แน่ใจว่าทุกขั้นตอนดำเนินการและบันทึกข้อมูลอย่างถูกต้อง
• ผู้ควบคุมคุณภาพ: ตรวจสอบผลการทดสอบและยืนยันความถูกต้องตามมาตรฐานที่กำหนด
• ผู้จัดการห้องปฏิบัติการ: ควบคุมและปรับปรุงขั้นตอนตามความจำเป็น และตรวจสอบให้อุปกรณ์ทุกชิ้นได้รับการสอบเทียบและบำรุงรักษาอย่างเหมาะสม

4. วัสดุและอุปกรณ์

วัสดุ

• ตัวอย่าง (ของเหลว, ของแข็ง หรือที่ผ่านการบดละเอียด)
• สารละลายเจือจางปราศจากเชื้อ (เช่น น้ำเปปโตน้อย 0.1% หรือฟอสเฟตบัฟเฟอร์)
• สื่อเพาะเชื้อ Plate Count Agar (หรือสื่อเพาะเชื้อที่ได้รับการอนุมัติ)
• หัวปิเปตและปิเปต/ไมโครปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• หลอดหรือภาชนะสำหรับเจือจางที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• จานเพาะเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• ถุงมือใช้ครั้งเดียว, เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ และแว่นตานิรภัย

อุปกรณ์

• เครื่องสั่น (Vortex Mixer)
• ตู้บ่มเพาะ (Incubator) ที่ตั้งอุณหภูมิตามที่กำหนด (โดยปกติ 35°C ± 2°C)
• เครื่องนับอาณานิคม (แบบแมนนวลหรืออัตโนมัติ)
• ปากกามาร์กเกอร์สำหรับติดฉลาก

5. ขั้นตอนการปฏิบัติงาน

5.1 การรับและเตรียมตัวอย่าง

1. การรับและบันทึกข้อมูล:

   • ตรวจสอบข้อมูลตัวอย่าง (เช่น รหัสตัวอย่าง, วันที่เก็บ, ประเภทของตัวอย่าง) และบันทึกไว้ในสมุดบันทึกของห้องปฏิบัติการ
   • ตรวจสอบสภาพตัวอย่างให้แน่ใจว่าถูกเก็บรักษาและขนส่งอย่างเหมาะสม

2. การทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกัน:

   • สำหรับตัวอย่างของเหลว: คนหรือเขย่าให้เข้ากันอย่างทั่วถึง
   • สำหรับตัวอย่างของแข็ง: ใช้เครื่องบดหรือ stomacher ผสมตัวอย่างกับสารละลายเจือจางที่ปราศจากเชื้อในปริมาณที่เหมาะสม
   • บันทึกน้ำหนักของตัวอย่าง (สำหรับของแข็ง) หรือปริมาณ (สำหรับของเหลว)

5.2 การเจือจางแบบอนุกรม

1. การเตรียมหลอด:

   • ติดฉลากหลอดเจือจางที่ผ่านการฆ่าเชื้อให้แสดงระดับการเจือจางที่ต้องการ (เช่น 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ ฯลฯ)

2. ขั้นตอนการเจือจาง:

   • เทตัวอย่าง 1 mL ลงในสารละลายเจือจาง 9 mL เพื่อให้ได้การเจือจาง 1:10 (10⁻¹)
   • ใช้เครื่องสั่น (vortex) คนหลอดประมาณ 15–30 วินาทีให้เข้ากัน
   • ทำการเจือจางแบบอนุกรมต่อไปจนได้ระดับที่ทำให้จานเพาะเชื้อแสดงอาณานิคมในช่วงที่นับได้ (โดยปกติ 30–300 อาณานิคมต่อจาน)

5.3 การเพาะเชื้อบนจาน

1. การเลือกระดับเจือจาง:

   • เลือกระดับเจือจางที่คาดว่าจะให้ผลจานที่มีอาณานิคมในช่วงที่นับได้
   • เพาะในหลายระดับเพื่อความแน่ใจว่ามีจานที่อยู่ในช่วงนับได้

2. วิธีการเพาะเชื้อ:

   • วิธี Spread Plate:
     • ใช้ปริมาตรที่กำหนด (โดยปกติ 0.1 mL) จากระดับเจือจางที่เลือก วางบนพื้นผิวของจานเพาะเชื้อที่เตรียมไว้
     • ใช้อุปกรณ์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (เช่น spreader หรือแท่งแก้ว) แพร่กระจายตัวอย่างให้ทั่วพื้นผิวจาน
   • วิธี Pour Plate (ถ้ามี):
     • ผสมระดับเจือจางกับสื่อเพาะเชื้อที่อุ่นตัวแล้ว (เย็นลงประมาณ 45–50°C) แล้วเทลงในจานเพาะเชื้อให้สื่อเซ็ตตัว

3. การติดฉลากจาน:

   • ติดฉลากจานเพาะเชื้อให้ชัดเจนโดยระบุรหัสตัวอย่าง, ระดับเจือจาง, และวันที่เพาะเชื้อ

5.4 การบ่มเพาะ

1. เงื่อนไขการบ่มเพาะ:

   • วางจานเพาะเชื้อกลับหัว (เพื่อป้องกันหยดน้ำคอนเดนส์)
   • บ่มเพาะที่อุณหภูมิที่กำหนด (เช่น 35°C ± 2°C) เป็นเวลา 24–48 ชั่วโมง (ปรับเวลาและอุณหภูมิตามความเหมาะสมของตัวอย่าง)

2. การตรวจสอบ:

   • ตรวจสอบสภาพภายในตู้บ่มเพาะเป็นระยะเพื่อให้แน่ใจว่าตรงตามข้อกำหนด

5.5 การนับอาณานิคม

1. การเลือกจาน:

   • หลังจากการบ่มเพาะแล้ว ให้เลือกจานที่มีอาณานิคมอยู่ในช่วง 30–300 อาณานิคม เพื่อให้ได้ผลการนับที่น่าเชื่อถือ

2. การนับอาณานิคม:

   • นับอาณานิคมด้วยตนเองหรือใช้เครื่องนับอาณานิคมอัตโนมัติ
   • บันทึกจำนวนอาณานิคมพร้อมกับระดับเจือจางและปริมาตรที่เพาะ

3. การตรวจสอบความถูกต้อง:

   • หากจานมีอาณานิคมมากเกินไป (overgrown) หรือมีน้อยเกินไป ให้บันทึกผลและพิจารณาทำการเพาะใหม่ด้วยระดับเจือจางที่แตกต่างกัน