การนับจำนวน Escherichia coli (E. coli) ในตัวอย่างต่าง ๆ โดยใช้วิธีการเจือจางแบบอนุกรมและการเพาะเชื้อบนจานที่มีสื่อเพาะเชื้อแบบเลือกและแตกต่าง (selective/differential media)

ขั้นตอนการทดสอบ E. coli ทั้งหมด

1. วัตถุประสงค์

เพื่อกำหนดวิธีการมาตรฐานในการนับจำนวน Escherichia coli (E. coli) ในตัวอย่างต่าง ๆ โดยใช้วิธีการเจือจางแบบอนุกรมและการเพาะเชื้อบนจานที่มีสื่อเพาะเชื้อแบบเลือกและแตกต่าง (selective/differential media) วิธีนี้ช่วยให้สามารถตรวจจับและนับจำนวน E. coli ได้อย่างถูกต้องผ่านลักษณะของอาณานิคมที่ปรากฏบนจาน

2. ขอบเขต

ขั้นตอนนี้ใช้สำหรับตัวอย่างน้ำ, อาหาร และตัวอย่างสิ่งแวดล้อมที่ส่งเข้ามาทดสอบ E. coli ทั้งหมดในห้องปฏิบัติการ

3. ความรับผิดชอบ

• เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการ:
  ปฏิบัติตามขั้นตอนการทดสอบนี้ให้ครบถ้วนและบันทึกข้อมูลอย่างถูกต้องในทุกขั้นตอน

• ผู้ควบคุมคุณภาพ:
  ตรวจสอบผลการทดสอบและเอกสารเพื่อให้เป็นไปตามมาตรฐานคุณภาพที่กำหนด

• ผู้จัดการห้องปฏิบัติการ:
  ควบคุมและปรับปรุงขั้นตอนนี้ตามความจำเป็น และตรวจสอบให้อุปกรณ์ทุกชิ้นได้รับการสอบเทียบและบำรุงรักษาอย่างถูกต้อง

4. วัสดุและอุปกรณ์

วัสดุ

• ตัวอย่าง (ของเหลว, ของแข็ง หรือที่ผ่านการบดละเอียด)
• สารละลายเจือจางปราศจากเชื้อ (เช่น น้ำเปปโตน้อย 0.1% หรือฟอสเฟตบัฟเฟอร์)
• สื่อเพาะเชื้อแบบเลือกและแตกต่างสำหรับ E. coli (เช่น MacConkey Agar, Eosin Methylene Blue (EMB) Agar หรือ Chromogenic E. coli Agar)
• หัวปิเปตและปิเปต/ไมโครปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• หลอดหรือภาชนะสำหรับเจือจางที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• จานเพาะเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• ถุงมือใช้ครั้งเดียว, เสื้อคลุมห้องปฏิบัติการ และแว่นตานิรภัย

อุปกรณ์

• เครื่องสั่น (Vortex Mixer)
• ตู้บ่มเพาะ (Incubator) ที่ตั้งอุณหภูมิ 37°C ± 1°C (หรือตามที่ระบุไว้)
• เครื่องนับอาณานิคม (แบบแมนนวลหรืออัตโนมัติ)
• ปากกามาร์กเกอร์สำหรับติดฉลาก

5. ขั้นตอนการปฏิบัติงาน

5.1 การรับและเตรียมตัวอย่าง

1. การรับและบันทึกข้อมูล:

   • ตรวจสอบข้อมูลตัวอย่าง (เช่น รหัสตัวอย่าง, วันที่เก็บ, ประเภทของตัวอย่าง) และบันทึกข้อมูลลงในสมุดบันทึกของห้องปฏิบัติการ
   • ตรวจสอบสภาพของตัวอย่างให้แน่ใจว่าได้รับการเก็บรักษาและขนส่งอย่างเหมาะสม

2. การทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกัน:

   • สำหรับตัวอย่างของเหลว: คนหรือเขย่าให้เข้ากันอย่างทั่วถึง
   • สำหรับตัวอย่างของแข็ง: ใช้เครื่องบดหรือ stomacher ผสมตัวอย่างกับสารละลายเจือจางปราศจากเชื้อในปริมาณที่เหมาะสม
   • บันทึกน้ำหนัก (สำหรับของแข็ง) หรือปริมาตร (สำหรับของเหลว) ของตัวอย่าง

5.2 การเจือจางแบบอนุกรม

1. การเตรียมหลอด:

   • ติดฉลากหลอดเจือจางที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยระดับการเจือจางที่ต้องการ (เช่น 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ ฯลฯ)

2. ขั้นตอนการเจือจาง:

   • เทตัวอย่าง 1 mL ลงในสารละลายเจือจาง 9 mL เพื่อให้ได้การเจือจาง 1:10 (10⁻¹)
   • ใช้เครื่องสั่น (vortex) คนหลอดประมาณ 15–30 วินาทีเพื่อให้เข้ากันอย่างทั่วถึง
   • ทำการเจือจางแบบอนุกรมต่อไปจนได้ระดับที่ทำให้ได้จานเพาะเชื้อที่มีอาณานิคมอยู่ในช่วงที่นับได้ (โดยปกติ 30–300 อาณานิคมต่อจาน)

5.3 การเพาะเชื้อบนจาน

1. การเลือกระดับเจือจาง:

   • เลือกระดับเจือจางที่คาดว่าจะให้จานเพาะเชื้อที่มีอาณานิคมในช่วงที่นับได้
   • เพาะในหลายระดับหากจำเป็น เพื่อให้แน่ใจว่ามีจานที่อยู่ในช่วงที่นับได้

2. วิธีการเพาะเชื้อ:

   • วิธี Spread Plate:
     • ใช้ปริมาตรที่กำหนด (โดยปกติ 0.1 mL) จากระดับเจือจางที่เลือก วางลงบนพื้นผิวของจานเพาะเชื้อที่เตรียมไว้
     • ใช้อุปกรณ์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (เช่น spreader หรือแท่งแก้ว) แพร่กระจายตัวอย่างให้ทั่วจาน
   • วิธี Pour Plate (ถ้ามี):
     • ผสมระดับเจือจางกับสื่อเพาะเชื้อแบบเลือกและแตกต่างที่อุ่นตัวแล้ว (เย็นลงประมาณ 45–50°C) แล้วเทลงในจานเพาะเชื้อให้สื่อเซ็ตตัว

3. การติดฉลาก:

   • ติดฉลากจานเพาะเชื้อให้ชัดเจน โดยระบุรหัสตัวอย่าง, ระดับเจือจาง, และวันที่เพาะเชื้อ

5.4 การบ่มเพาะ

1. เงื่อนไขการบ่มเพาะ:

   • วางจานเพาะเชื้อกลับหัว เพื่อป้องกันหยดน้ำคอนเดนส์
   • บ่มเพาะที่อุณหภูมิ 37°C ± 1°C เป็นเวลา 18–24 ชั่วโมง (หรือระบุไว้ตามมาตรฐาน)
   • อาณานิคมของ E. coli จะปรากฏด้วยลักษณะเฉพาะ (เช่น สีชมพู/แดงบน MacConkey Agar, เมตัลลิคกรีนบน EMB Agar หรือสีที่แตกต่างบนสื่อ Chromogenic)

2. การตรวจสอบ:

   • ตรวจสอบสภาพในตู้บ่มเพาะเป็นระยะเพื่อให้แน่ใจว่าอยู่ในช่วงที่กำหนด

5.5 การนับอาณานิคม

1. การเลือกจาน:

   • หลังจากบ่มเพาะแล้ว เลือกจานที่มีอาณานิคมอยู่ในช่วง 30–300 อาณานิคมสำหรับการนับที่แม่นยำ

2. การนับอาณานิคม:

   • นับอาณานิคมที่แสดงลักษณะเฉพาะของ E. coli ด้วยตนเองหรือด้วยเครื่องนับอาณานิคม
   • บันทึกจำนวนอาณานิคมพร้อมกับระดับเจือจางและปริมาตรที่เพาะ

3. การตรวจสอบความถูกต้อง:

   • หากจำนวนอาณานิคมมากเกินไปหรือมีน้อยเกินไป ให้บันทึกผลและพิจารณาทำการเพาะใหม่ด้วยระดับเจือจางที่แตกต่างกัน