Staphylococcus Aureus Counting Service

วัสดุและอุปกรณ์

• ตัวอย่าง: (เช่น อาหาร, สภาพแวดล้อม หรือตัวอย่างทางคลินิก)
• น้ำละลายปราศจากเชื้อ: (เช่น buffered peptone water หรือ saline solution)
• เครื่องปั่น (stomacher) หรือเครื่อง homogenizer: (สำหรับตัวอย่างของแข็ง)
• ถุงปั่นหรือหลอดที่ปราศจากเชื้อ
• ปิเปตและปลายปิเปตที่ปราศจากเชื้อ
• หลอดหรือภาชนะสำหรับการเจือจางที่ปราศจากเชื้อ
• กลางการปลูกจานที่เลือกเฉพาะ:
  • Baird–Parker Agar ที่เติม egg yolk tellurite
    (อาจใช้กลางการปลูกอื่นๆ ตามที่ระบุในขั้นตอนการทดลอง)
• เครื่องกระจายเชื้อ (sterile spreaders) หรือห่วงปลูกจานที่ใช้แล้วทิ้ง
• เครื่องบ่ม: ตั้งอุณหภูมิที่ 35–37°C
• เครื่องนับโคโลนี หรืออุปกรณ์ช่วยนับแบบแมนนวล
• อุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE): (เช่น เสื้อคลุม, ถุงมือ, แว่นตานิรภัย)

ขั้นตอนการปฏิบัติ

1. การเตรียมตัวอย่าง

• ชั่งหรือตัวอย่าง:
  สำหรับตัวอย่างของแข็ง (เช่น อาหาร) ชั่ง 25 กรัมแล้วใส่ลงในถุงปั่นที่ปราศจากเชื้อ สำหรับตัวอย่างของเหลว ให้วัดปริมาณที่เหมาะสม
• เจือจางตัวอย่าง:
  เติมน้ำละลายปราศจากเชื้อ 225 mL ลงในตัวอย่าง 25 กรัม เพื่อให้ได้การเจือจางเริ่มต้นในอัตราส่วน 1:10 จากนั้นผสมให้เข้ากันอย่างทั่วถึงโดยใช้เครื่องปั่นหรือการเขย่าอย่างแรง

2. การเจือจางแบบต่อเนื่อง

• เตรียมการเจือจาง:
  • โอนตัวอย่าง 1 mL จากส่วนผสมที่เตรียมไว้ลงในน้ำละลายปราศจากเชื้อ 9 mL เพื่อให้ได้การเจือจางในอัตราส่วน 1:100
  • ทำการเจือจางแบบสิบเท่าต่อเนื่องตามที่จำเป็นเพื่อให้ได้ระดับการเจือจางที่ให้จำนวนโคโลนีบนจานอยู่ในช่วงที่นับได้ (โดยทั่วไป 30 ถึง 300 โคโลนีต่อจาน)

3. การปลูกจาน

• เทคนิคการปลูกจาน:
  • สำหรับแต่ละระดับการเจือจางที่เลือก ให้หยด 0.1 mL ของตัวอย่างลงบนพื้นผิวของจาน Baird–Parker agar ที่เตรียมไว้ล่วงหน้า
  • ใช้เครื่องกระจายเชื้อที่ปราศจากเชื้อ (หรืออุปกรณ์ที่ใช้แล้วทิ้ง) กระจายตัวอย่างให้ทั่วพื้นผิวจาน
  • ปฏิบัติงานอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนและรักษาสภาพแวดล้อมที่ปราศจากเชื้อ

4. การบ่มจาน

• บ่มจาน:
  • นำจานที่ถูกปลูกไปใส่ในเครื่องบ่มที่ตั้งอุณหภูมิที่ 35–37°C
  • บ่มจานเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมง (ตรวจสอบตามแนวทางที่ใช้อยู่; บางวิธีการแนะนำให้บ่ม 48 ชั่วโมงเพื่อให้ลักษณะของโคโลนีชัดเจน)

5. การระบุและนับโคโลนี

• ตรวจสอบจาน:
  • หลังจากการบ่มแล้ว ตรวจสอบจานเพื่อดูโคโลนี บน Baird–Parker agar โคโลนีของ S. aureus มักจะแสดงลักษณะเฉพาะดังนี้:
    • ลักษณะ: โคโลนีสีเทาถึงดำ, มันวาว, รูปทรงนูน (convex)
    • วงแสง: มักมีขอบโคโลนีที่มีเขตสีใส (เนื่องจากกิจกรรม lecithinase)
• นับโคโลนี:
  • เลือกจานที่มีจำนวนโคโลนีอยู่ในช่วง 30 ถึง 300 โคโลนี เพื่อให้ได้ผลการนับที่น่าเชื่อถือ
  • นับโคโลนีที่มีลักษณะตรงกับที่คาดว่าเป็น S. aureus หากผลการนับในระดับการเจือจางแตกต่างกัน ให้เลือกระดับที่ให้ผลนับที่มีความน่าเชื่อถือสูงสุด