เมทิลีนบลูใช้ในการแพทย์เพื่อเป็นสารย้อมสีในการตรวจสอบตัวอย่างทางจุลชีววิทยาและพยาธิวิทยา ช่วยในการระบุเชื้อแบคทีเรียและเชื้อราภายใต้กล้องจุลทรรศน์ นอกจากนี้ยังใช้ในการรักษาภาวะเมทฮีโมโกลบินีเมีย ซึ่งเป็นภาวะที่เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในด้านการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ เมทิลีนบลูใช้เป็นตัวบ่งชี้รีดอกซ์ในการทดลองทางเคมีและชีวเคมี เพื่อวัดการเปลี่ยนแปลงของปฏิกิริยาออกซิเดชันและรีดักชัน นอกจากนี้ยังมีการใช้ในอุตสาหกรรมสิ่งทอเป็นสารย้อมสีผ้าและในอุตสาหกรรมอาหารเพื่อตรวจสอบคุณภาพของผลิตภัณฑ์