ใช้โปรฟลาวีนเฮมีซัลเฟตเป็นยาฆ่าเชื้อทาผิวหนังสำหรับแผลเล็กน้อยและแผลไหม้ เนื่องจากมีคุณสมบัติต้านแบคทีเรีย โดยมีประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียแกรมบวกหลายชนิด และนิยมใช้ในสัตวแพทย์และการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อป้องกันการติดเชื้อในปลา นอกจากนี้ยังใช้ในชีววิทยาโมเลกุลเป็นโปรบเรืองแสงสำหรับศึกษากโครงสร้างกรดนิวคลีอิก โดยเฉพาะการตรวจจับและแสดงภาพ RNA ความสามารถในการแทรกตัวเข้าไปใน DNA ทำให้มีคุณค่าในการวิจัยเกี่ยวกับพลวัตของกรดนิวคลีอิกและการแสดงออกของยีน ในทางการแพทย์ ใช้สำหรับแผลติดเชื้อ โดยเฉพาะแผลไหม้หรือแผลเปิด เพื่อป้องกันการติดเชื้อแบคทีเรีย เนื่องจากมีฤทธิ์ต้านจุลชีพต่อแบคทีเรียแกรมบวกและบางชนิดของแบคทีเรียแกรมลบ นิยมใช้ในรูปของผงโรยแผลหรือสารละลายทาแผล