อะมพิซิลลินใช้กันอย่างแพร่หลายในการรักษาการติดเชื้อแบคทีเรียที่เกิดจากจุลินทรีย์ที่ไวต่อยา มีประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียแกรมบวกหลายชนิดและบางชนิดของแบคทีเรียแกรมลบ การนำไปใช้ทั่วไป ได้แก่ การรักษาการติดเชื้อทางเดินหายใจ ทางเดินปัสสาวะ เยื่อหุ้มสมองอักเสบ และการติดเชื้อทางเดินอาหารที่เกิดจากแบคทีเรีย เช่น Escherichia coli, Haemophilus influenzae และสายพันธุ์บางชนิดของ Salmonella และ Shigella

ในสถานพยาบาล อะมพิซิลลินให้ทางปาก ทางหลอดเลือดดำ หรือฉีดเข้ากล้ามเนื้อ ขึ้นอยู่กับความรุนแรงของการติดเชื้อ มักใช้ร่วมกับยาปฏิชีวนะอื่น ๆ เช่น ซัลแบคแทน เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เบต้า-แลคตาเมส

ในงานวิจัยห้องปฏิบัติการ อะมพิซิลลินใช้เป็นตัวคัดเลือกในชีววิทยาโมเลกุลบ่อยครั้ง ช่วยรักษาเวกเตอร์พลาสมิดในการเพาะปลูกแบคทีเรีย โดยเฉพาะ E. coli โดยการคัดเลือกเซลล์ที่รับยีนต้านทานยาปฏิชีวนะระหว่างการแปลงพันธุกรรม ทำให้เป็นเครื่องมือสำคัญในวิศวกรรมพันธุกรรมและเทคโนโลยีดีเอ็นเอรีคอมบิแนนต์

อะมพิซิลลินทำงานโดยยับยั้งการสังเคราะห์ผนังเซลล์ของแบคทีเรีย ทำให้แบคทีเรียตาย เหมาะสำหรับการติดเชื้อทางเดินหายใจ หู คอ จมูก ระบบทางเดินปัสสาวะ และระบบทางเดินอาหาร