เตตราไซคลินถูกใช้อย่างแพร่หลายในฐานะยาปฏิชีวนะในการรักษาการติดเชื้อแบคทีเรียหลายชนิด มีประสิทธิภาพต่อการติดเชื้อทางเดินหายใจ การติดเชื้อทางเดินปัสสาวะ การติดเชื้อผิวหนัง และโรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์บางชนิด เช่น ไคลมีเดีย นอกจากนี้ ยังใช้ในการรักษาสิวและโรซาเซียเนื่องจากคุณสมบัติต้านการอักเสบ ในยาสัตว์ เตตราไซคลินมักถูกให้แก่ปศุสัตว์เพื่อป้องกันและรักษาการติดเชื้อแบคทีเรีย ยังใช้ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อควบคุมโรคแบคทีเรียในปลา นอกเหนือจากงานทางการแพทย์ เตตราไซคลินถูกใช้ในงานวิจัยเป็นสารเลือกในชีววิทยาโมเลกุลเพื่อระบุสิ่งมีชีวิตที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรม ความสามารถในการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนทำให้เป็นเครื่องมือที่มีค่าทั้งในคลินิกและห้องปฏิบัติการ