Trimetrexate ใช้ในการรักษาโรคติดเชื้อบางชนิด เช่น ปอดอักเสบจากเชื้อ Pneumocystis jirovecii ในผู้ป่วยที่มีระบบภูมิคุ้มกันบกพร่อง โดยเฉพาะผู้ป่วยโรคเอดส์ ยานี้ทำงานโดยการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ dihydrofolate reductase ซึ่งจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ DNA และ RNA ของเชื้อโรค ทำให้เชื้อไม่สามารถเพิ่มจำนวนได้ นอกจากนี้ยังมีการศึกษาการใช้ Trimetrexate ในการรักษาโรคมะเร็งบางชนิด เนื่องจากมีกลไกการออกฤทธิ์ที่คล้ายคลึงกับยาเคมีบำบัดอื่น ๆ ที่ใช้ในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็ง