Hemicholinium-3 ใช้หลักๆ ในงานวิจัยเพื่อศึกษากลไกของการส่งสัญญาณประสาทแบบโคลินเออร์จิก โดยทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งแบบแข่งขันของระบบดูดซึมโคลีนที่มีความสูง ซึ่งลดการสังเคราะห์อะเซทิลโคลีนในปลายประสาทอย่างมีประสิทธิภาพ คุณสมบัตินี้ทำให้เป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าต่อการตรวจสอบบทบาทของอะเซทิลโคลีนในกระบวนการทางสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาต่างๆ เช่น ความจำ การเรียนรู้ และการทำงานของระบบประสาทกล้ามเนื้อ นอกจากนี้ ยังนำมาใช้ในโมเดลทดลองเพื่อสำรวจภาวะต่างๆ เช่น โรคไมอัสเทนีกราเวส และความผิดปกติอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณโคลินเออร์จิก การประยุกต์ใช้ช่วยในการทำความเข้าใจผลกระทบของระดับอะเซทิลโคลีนที่ลดลงต่อระบบประสาท และในการพัฒนากลยุทธ์การรักษาที่เป็นไปได้