5-Methyltetrahydrofolic acid ใช้หลักๆ ในด้านการแพทย์และโภชนาการ มีบทบาทสำคัญในการสนับสนุนสุขภาพและการทำงานของเซลล์ ใช้เป็นอาหารเสริมเพื่อช่วยจัดการภาวะขาดโฟเลต ซึ่งจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์และซ่อมแซม DNA รวมถึงการผลิตเม็ดเลือดแดง สารนี้มีประโยชน์เป็นพิเศษสำหรับบุคคลที่มีความแปรปรวนทางพันธุกรรม เช่น ภาวะกลายพันธุ์ MTHFR ซึ่งทำให้ร่างกายไม่สามารถแปลงกรดโฟลิกเป็นรูปแบบที่ใช้งานได้

นอกจากนี้ ยังนำไปใช้ในวิตามินสำหรับสตรีมีครรภ์เพื่อสนับสนุนการเจริญเติบโตของทารกในครรภ์และลดความเสี่ยงของความผิดปกติของท่อประสาท ในสถานพยาบาล ยังใช้เพื่อสนับสนุนสุขภาพหัวใจและหลอดเลือดโดยการควบคุมระดับ homocysteine ซึ่งอาจช่วยลดความเสี่ยงของภาวะหัวใจและหลอดเลือด