เมทิลบลูถูกใช้อย่างแพร่หลายในด้านการแพทย์และวิทยาศาสตร์ โดยเฉพาะในการย้อมสีตัวอย่างทางชีววิทยาเพื่อให้เห็นโครงสร้างของเซลล์และเนื้อเยื่อได้ชัดเจนขึ้น ในทางจุลชีววิทยา มันมักใช้ในการย้อมสีแบคทีเรียเพื่อช่วยในการจำแนกชนิด นอกจากนี้ยังใช้ในทางเคมีวิเคราะห์เป็นตัวบ่งชี้ (indicator) ในการทดสอบทางเคมีบางชนิด เช่น การทดสอบหาปริมาณออกซิเจนในน้ำ เมทิลบลูยังมีบทบาทในการศึกษาด้านชีวเคมี โดยช่วยในการติดตามปฏิกิริยาและการเคลื่อนที่ของโมเลกุลในเซลล์