เมทิลีนบลู ไตรไฮเดรตใช้กันอย่างแพร่หลายในสถานพยาบาลเป็นเครื่องมือวินิจฉัยและการรักษา ใช้เป็นสีย้อมในกระบวนการย้อมสีต่างๆ โดยเฉพาะในกล้องจุลทรรศน์ เพื่อเพิ่มความชัดเจนของโครงสร้างเซลล์ ช่วยในการวินิจฉัยโรคต่างๆ เช่น การตรวจหาแบคทีเรียหรือเชื้อรา ในทางคลินิก ใช้รักษาภาวะเมทฮีโมโกลบินีเมีย ซึ่งเป็นภาวะที่เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยการแปลงเมทฮีโมโกลบินกลับเป็นฮีโมโกลบิน นอกจากนี้ ยังใช้เป็นยาแก้พิษสำหรับการวางยาพิษไซยาไนด์ โดยการสร้างสารประกอบที่ไม่เป็นพิษกับไอออนไซยาไนด์ ในขั้นตอนการผ่าตัด ใช้เพื่อระบุต่อมน้ำเหลืองเซนติเนลใน手术มะเร็ง ช่วยในการ定位เนื้องอก นอกเหนือจากการแพทย์ ใช้ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อรักษาการติดเชื้อเชื้อราและปรสิตในปลา เพื่อให้สภาพแวดล้อมสัตว์น้ำที่แข็งแรงต่อสุขภาพ ในด้านการวิจัย ใช้เป็นสารทดสอบในกระบวนการทางชีวเคมีและชีววิทยาโมเลกุล เพื่อศึกษากลไกของปฏิกิริยาออกซิเดชันและรีดักชัน ความหลากหลายของมันทำให้เป็นสารประกอบที่มีค่าทั้งในด้านการดูแลสุขภาพและการจัดการสิ่งแวดล้อม