นิโคตีลีนถูกใช้เป็นตัวชี้วัดในการตรวจสอบการสัมผัสกับควันบุหรี่มือสอง โดยเฉพาะในตัวอย่างเส้นผมหรือปัสสาวะของบุคคล เนื่องจากนิโคตีลีนเป็นสารเมตาบอลิซึมของนิโคตินที่เกิดขึ้นหลังจากการสูบบุหรี่หรือการสูดดมควันบุหรี่ จึงนิยมนำมาใช้ในการศึกษาวิจัยด้านสุขภาพ เพื่อประเมินระดับการสัมผัสสารพิษจากบุหรี่ในประชากรที่ไม่สูบบุหรี่แต่อยู่ในสภาพแวดล้อมที่มีการสูบบุหรี่ นอกจากนี้ยังใช้ในงานนิติวิทยาศาสตร์เพื่อยืนยันการสัมผัสหรือการสูบบุหรี่ในกรณีที่ต้องการหลักฐานเชิงประจักษ์