5,10-เมทิลีนเทตระไฮโดรโฟเลต (5,10-CH₂-THF) เป็นสารกลางสำคัญในเส้นทางเมแทบอลิซึมคาร์บอนตัวเดียวของโฟเลต โดยทำหน้าที่หลักในการบริจาคกลุ่มเมทิลีนสำหรับการสังเคราะห์ไทมิดิเลต (dTMP) จากดีออกซียูริดิเลต (dUMP) ซึ่งเกิดขึ้นโดยเอนไซม์ไทมิดิเลตซินเทส กระบวนการนี้จำเป็นต่อการสังเคราะห์ ซ่อมแซม และการเพิ่มจำนวนของ DNA ทำให้เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์และเป็นเป้าหมายในการรักษามะเร็ง นอกจากนี้ 5,10-CH₂-THF ยังถูกแปลงเป็น 5-เมทิลเทตระไฮโดรโฟเลตโดยเอนไซม์เมทิลีนเทตระไฮโดรโฟเลตเรดักเตส (MTHFR) ซึ่งทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคกลุ่มเมทิลในการรีเมทิลเลชันของโฮโมซิสเทอีนเป็นเมไทโอนีน กระบวนการนี้สนับสนุนเมแทบอลิซึมของกรดอะมิโน การสังเคราะห์โปรตีน และเกี่ยวข้องกับสุขภาพหลอดเลือดและระบบประสาท ความผิดปกติในเส้นทางนี้ เช่น การกลายพันธุ์ของ MTHFR อาจนำไปสู่ระดับโฮโมซิสเทอีนสูง ซึ่งสัมพันธ์กับความบกพร่องของท่อประสาท โรคหัวใจและหลอดเลือด และความเสี่ยงมะเร็ง สารนี้ถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในการวิจัยทางชีวเคมีและการเสริมโภชนาการสำหรับภาวะที่เกี่ยวข้องกับโฟเลต