เจนตามัยซิน ซัลเฟตใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นยาปฏิชีวนะทั้งในทางการแพทย์มนุษย์และสัตวแพทย์ มีประสิทธิภาพโดยเฉพาะต่อการติดเชื้อแบคทีเรียในวงกว้าง รวมถึงที่เกิดจากแบคทีเรียแกรมลบและบางชนิดแกรมบวก ในสถานพยาบาล มักใช้รักษาการติดเชื้อรุนแรง เช่น ภาวะติดเชื้อในกระแสเลือด การติดเชื้อทางเดินหายใจ การติดเชื้อทางเดินปัสสาวะ และการติดเชื้อที่ผิวหนังกับเนื้อเยื่ออ่อน ยังใช้รักษาการติดเชื้อตา มักในรูปแบบยาหยอดตาหรือครีมทา ในสัตวแพทย์ ใช้จัดการการติดเชื้อแบคทีเรียในสัตว์ รวมถึงปศุสัตว์และสัตว์เลี้ยง นอกจากนี้ บางครั้งผสมในครีมทาและน้ำยาสำหรับดูแลแผลและป้องกันการติดเชื้อในแผลไหม้หรือจุดผ่าตัด ในการประยุกต์ใช้ในห้องปฏิบัติการและเทคโนโลยีชีวภาพ เจนตามัยซิน ซัลเฟตใช้กันทั่วไปในอาหารเลี้ยงเซลล์เป็นยาปฏิชีวนะเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของแบคทีเรีย โดยเฉพาะในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม คุณสมบัติต้านแบคทีเรียที่แรงทำให้เป็นส่วนสำคัญในการต่อสู้กับเชื้อดื้อยา แม้การใช้ต้องเฝ้าระวังเนื่องจากผลข้างเคียงที่อาจเกิด เช่น ไตพิษและหูพิษ