2,5-Dithiobiurea ใช้หลักๆ เป็นสารเคมีทดสอบในเคมีวิเคราะห์สำหรับการตรวจจับและวัดปริมาณไอออนโลหะ โดยเฉพาะทองแดงและเหล็ก เนื่องจากความสามารถในการสร้างคอมเพล็กซ์ที่เสถียร นอกจากนี้ยังใช้ในการสังเคราะห์สารประกอบอินทรีย์ โดยทำหน้าที่เป็นส่วนประกอบพื้นฐานสำหรับโครงสร้างเฮเตอร์โรไซคลิก ในวิทยาศาสตร์วัสดุ มีการนำไปใช้ในการพัฒนาโพลิเมอร์และเรซิน โดยทำหน้าที่เป็นสารเชื่อมขวางเพื่อเพิ่มคุณสมบัติทางกล นอกจากนี้ ยังใช้ในการศึกษาการยับยั้งการกัดกร่อน ซึ่งช่วยปกป้องพื้นผิวโลหะจากการเสื่อมสภาพในสภาพแวดล้อมที่รุนแรง บทบาทในชีวเคมีรวมถึงการวิจัยเกี่ยวกับการยับยั้งเอนไซม์และปฏิกิริยาโปรตีน ซึ่งมีส่วนช่วยในการทำความเข้าใจเส้นทางชีวเคมี