ใช้เป็นสารตั้งต้นในการผลิตยาต้านมะเร็ง โดยเฉพาะยาที่มีกลไกการยับยั้งเอนไซม์ dihydrofolate reductase (DHFR) ซึ่งมีความสำคัญต่อการสังเคราะห์กรดโฟลิกในเซลล์ที่แบ่งตัวเร็ว เช่น เซลล์มะเร็ง จึงช่วยชะลอหรือยับยั้งการเติบโตของเซลล์มะเร็งได้ นิยมนำไปใช้ในกระบวนการพัฒนายาในรูปแบบของ conjugate หรือ prodrug เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการเข้าจับเป้าหมายเฉพาะและลดผลข้างเคียงต่อเซลล์ปกติ นอกจากนี้ยังใช้ในงานวิจัยด้านชีวเคมีเพื่อศึกษาเส้นทางการเผาผลาญกรดโฟลิกและกลไกของยาต้านการแบ่งเซลล์