Total Mold and Yeast Counting Service

ขั้นตอนการนับเชื้อราและยีสต์ทั้งหมด

A. วัสดุและสารละลาย

• ตัวอย่าง: วัสดุที่ทำการวิเคราะห์ ไม่ว่าจะเป็นอาหาร, สิ่งแวดล้อม หรือวัสดุอื่น ๆ
• สารละลายเจือจาง: เช่น น้ำ 0.1% Peptone หรือ PBS (Phosphate Buffered Saline) หรือสารละลายที่เหมาะสมและปราศจากเชื้อ
• ภาชนะสำหรับเจือจาง: หลอดหรือภาชนะที่ปราศจากเชื้อสำหรับทำการเจือจางแบบอนุกรม
• ปิเปตและปลายปิเปต: ปิเปตที่ปราศจากเชื้อและมีการสอบเทียบสำหรับการถ่ายปริมาณอย่างแม่นยำ
• เครื่องผสมหรือสโตมาจอร์: สำหรับการผสมตัวอย่างของแข็งให้เป็นเนื้อเดียว
• วุ้นเลี้ยงเชื้อราและยีสต์:
  • Sabouraud Dextrose Agar (SDA) มักถูกนำมาใช้
  • หรือ DG18 Agar โดยเฉพาะเมื่อทำงานกับตัวอย่างที่มีความชื้นต่ำ
• ยาปฏิชีวนะ (ถ้าจำเป็น): เช่น คลอرامฟีนikolหรือเจนทามัยซินที่เติมลงในวุ้นเพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย
• จานเพทรีปราศจากเชื้อ
• เครื่องอบเชื้อ (Incubator): ปรับอุณหภูมิตามที่เหมาะสม (โดยทั่วไป 25–30°C)
• เครื่องนับโคโลนี: แบบแมนนวลหรืออัตโนมัติ

B. ขั้นตอนการทำงานทีละขั้นตอน

1. การเตรียมตัวอย่าง

• สำหรับตัวอย่างของแข็ง:

  • ชั่งน้ำหนักตัวอย่างที่เหมาะสม (โดยทั่วไป 10 กรัม) ลงในถุงสำหรับผสม (เช่น ถุงสำหรับสโตมาจอร์) ที่ปราศจากเชื้อ
  • เติมสารละลายเจือจางปราศจากเชื้อ 90 มิลลิลิตร เพื่อให้ได้การเจือจางเริ่มต้นที่อัตราส่วน 1:10
  • ผสมตัวอย่างให้เป็นเนื้อเดียวอย่างทั่วถึงโดยใช้เครื่องสโตมาจอร์หรือเครื่องผสมที่เทียบเท่า

• สำหรับตัวอย่างของเหลว:

  • เขย่าหรือผสมตัวอย่างให้เข้ากัน
  • หากจำเป็น ให้นำส่วนของตัวอย่างไปเจือจางในสารละลายที่ปราศจากเชื้อ (เช่น อัตราส่วน 1:10) เพื่อลดภาระของจุลินทรีย์

2. การเจือจางแบบอนุกรม

• ทำการเจือจางแบบสิบเท่าต่อเนื่องโดยถ่าย 1 มิลลิลิตรของตัวอย่างที่ผสมแล้วลงในสารละลายปราศจากเชื้อ 9 มิลลิลิตร
• ผสมให้เข้ากันอย่างดี (โดยการสั่นหรือใช้เครื่อง vortex) เพื่อให้จุลินทรีย์กระจายอย่างทั่วถึง
• ทำการเจือจางต่อไปจนกว่าจะได้ระดับที่คาดว่าจะให้จำนวนโคโลนีที่นับได้ (โดยทั่วไปคือแผ่นที่มี 30–300 โคโลนี)

3. การเพาะลงบนจานเพทรี

คุณสามารถเลือกใช้วิธีเพาะเชื้อบนจานสองวิธีที่พบบ่อยได้:

A. วิธีการเทลงจาน (Pour Plate Method):

1. ถ่ายตัวอย่าง:
   ใช้ปิเปตถ่าย 1 มิลลิลิตรของการเจือจางที่เหมาะสมลงในจานเพทรีที่ปราศจากเชื้อ

2. เติมวุ้นเลี้ยง:
   เทวุ้นเลี้ยงที่ละลายและเย็นลง (ประมาณ 45–50°C) จำนวน 15–20 มิลลิลิตร (เช่น SDA ที่มีการเติมยาปฏิชีวนะ) ลงในจาน

3. ผสม:
   หมุนจานเบา ๆ เพื่อให้ตัวอย่างและวุ้นผสมเข้ากัน

4. ปล่อยให้แข็งตัว:
   รอจนวุ้นแข็งตัวที่อุณหภูมิห้อง

B. วิธีการกระจายตัวอย่างบนจาน (Spread Plate Method) (ถ้าจำเป็น):

1. เตรียมจาน:
   เทวุ้นเลี้ยงลงในจานและรอให้วุ้นแข็งตัว

2. ถ่ายตัวอย่าง:
   ใช้ปิเปตถ่ายปริมาณที่เหมาะสม (โดยทั่วไป 0.1 หรือ 1 มิลลิลิตร) ของการเจือจางลงบนพื้นผิววุ้น

3. กระจายตัวอย่าง:
   ใช้อุปกรณ์กระจายที่ปราศจากเชื้อ (เช่น แผ่นกระจายแก้วหรือพลาสติก) กระจายตัวอย่างให้ทั่วทั้งพื้นผิวจาน

หมายเหตุ: วิธีการเทลงจานมักถูกเลือกใช้ในการนับเชื้อราและยีสต์ เนื่องจากช่วยให้โคโลนีเจริญเติบโตทั้งบนและภายในวุ้น ซึ่งอาจเพิ่มอัตราการฟื้นตัวของจุลินทรีย์ได้

4. การบ่ม (Incubation)

• นำจานเพทรีที่ได้รับการเพาะเชื้อไปบ่มในเครื่องอบเชื้อที่อุณหภูมิ 25–30°C
• ระยะเวลาบ่มโดยทั่วไปอยู่ระหว่าง 5 ถึง 7 วัน
  • เชื้อรามักต้องใช้เวลาเต็ม 7 วันเพื่อให้เกิดโคโลนีที่มองเห็นได้
  • ยีสต์อาจเจริญเติบโตได้เร็วกว่า แต่เมื่อทำการนับทั้งสองกลุ่มร่วมกัน ให้ใช้เวลาบ่มที่ยาวนาน
• ตรวจสอบจานเพทรีเป็นระยะ ๆ เพื่อสังเกตการเจริญเติบโตของโคโลนี

5. การนับโคโลนี

• หลังจากการบ่มเสร็จสิ้น ให้เลือกจานที่มีโคโลนีระหว่าง 30 ถึง 300 ตัวสำหรับการนับที่แม่นยำ
• นับโคโลนีด้วยตนเองหรือใช้เครื่องนับโคโลนี
• หากจำนวนโคโลนีในระดับการเจือจางใด ๆ มากเกินไปจนไม่สามารถนับได้ ให้ใช้ผลการนับจากระดับการเจือจางที่สูงกว่า