บริการนับจำนวน Salmonella

ขั้นตอนการทดสอบ Salmonella

1. การเก็บตัวอย่างและการเตรียมตัวอย่าง

• การเก็บตัวอย่างอย่างถูกวิธี (Aseptic Sampling):
  เก็บตัวอย่าง (เช่น อาหาร น้ำ หรือการเก็บจากสิ่งแวดล้อม) โดยใช้เทคนิคที่ปราศจากการปนเปื้อน

• ขนาดตัวอย่าง:

  • ตัวอย่างของแข็ง: ชั่งน้ำหนัก 25 กรัม
  • ตัวอย่างของเหลว: ใช้ปริมาณที่เหมาะสม (เช่น 25–100 mL)

• การบดและผสม (Homogenization):
  นำตัวอย่างไปใส่ในภาชนะที่ปราศจากเชื้อแล้วเติมด้วย Buffered Peptone Water (BPW) ในอัตราส่วน 1:10 (เช่น 25 กรัมใน 225 mL BPW) จากนั้นบดหรือผสมให้เข้ากันโดยใช้เครื่องบด (stomacher) หรือเครื่องปั่น

2. การเพิ่มจำนวนในช่วงเริ่มต้น (Pre-enrichment)

• วัตถุประสงค์:
  เพื่อฟื้นฟูเซลล์ Salmonella ที่อาจได้รับความเครียดหรือบาดเจ็บและมีจำนวนต่ำในตัวอย่าง

• ขั้นตอน:
  บ่มตัวอย่างที่ผสมใน BPW ที่อุณหภูมิ 35 ± 1°C เป็นเวลา 18–24 ชั่วโมง ขั้นตอนนี้ช่วยเพิ่มจำนวนเซลล์ Salmonella ที่มีชีวิตก่อนเข้าสู่ขั้นตอนการเพิ่มจำนวนแบบคัดเลือก

3. การเพิ่มจำนวนแบบคัดเลือก (Selective Enrichment)

• เหตุผล:
  หลังจากการเพิ่มจำนวนในช่วงเริ่มต้น ตัวอย่างจะถูกโอนเข้าสู่น้ำยาเพิ่มจำนวนที่มีลักษณะคัดเลือกเพื่อส่งเสริมการเจริญเติบโตของ Salmonella ในขณะที่ยับยั้งจุลชีพอื่น ๆ

• น้ำยาเพิ่มจำนวนที่นิยมใช้:

  • Rappaport-Vassiliadis (RV) Broth: บ่มที่อุณหภูมิ 42 ± 0.5°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
  • Selenite Cystine (SC) Broth: บ่มที่อุณหภูมิ 35 ± 1°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
    (บางโปรโตคอลอาจใช้ทั้งสองน้ำยาในเวลาเดียวกันเพื่อเพิ่มความไวในการตรวจ)

4. การหว่านตัวอย่างลงบนสื่อเพาะเชื้อแบบคัดเลือก (Plating on Selective Agar Media)

• วัตถุประสงค์:
  เพื่อแยกและนับฝักของ Salmonella จากน้ำยาเพิ่มจำนวน

• สื่อเพาะเชื้อแบบคัดเลือก/แยกสีที่นิยมใช้:

  • Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar: Salmonella มักปรากฏเป็นฝักสีแดงที่มีจุดสีดำตรงกลาง
  • Hektoen Enteric (HE) Agar: Salmonella ปรากฏเป็นฝักสีเขียว-น้ำเงิน โดยอาจมีหรือไม่มีจุดสีดำ
  • Bismuth Sulfite (BS) Agar หรือ Salmonella-Shigella (SS) Agar: ใช้ในบางกรณี

• เทคนิคการหว่านตัวอย่าง:

  • การหว่านตรง: หยดหรือแพร่ตัวอย่างจากน้ำยาเพิ่มจำนวนลงบนแผ่นเพาะเชื้อ
  • การเจือจางอนุกรม (สำหรับการนับจำนวน): หากคาดว่ามีจำนวนแบคทีเรียสูง ให้ทำการเจือจางอนุกรมของตัวอย่างที่เพิ่มจำนวนแล้วและหว่านลงบนแผ่นเพาะเพื่อให้ได้จำนวนนับที่เหมาะสม (โดยทั่วไปอยู่ในช่วง 25–250 ฝักต่อแผ่น)

• การบ่ม (Incubation):
  นำแผ่นเพาะเชื้อไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 ± 1°C เป็นเวลา 24–48 ชั่วโมง หรือปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิตสื่อเพาะเชื้อหรือวิธีการมาตรฐานที่ใช้

5. การนับฝักและการระบุเบื้องต้น

• การนับฝัก:
  หลังการบ่ม นับจำนวนฝักที่แสดงลักษณะตามที่คาดว่าจะเป็นของ Salmonella บนสื่อเพาะเชื้อแบบคัดเลือก

  • หมายเหตุ: ควรนับเฉพาะแผ่นเพาะที่มีจำนวนฝักอยู่ในช่วงที่เชื่อถือได้ (โดยทั่วไป 25–250 ฝัก) เพื่อความแม่นยำในการนับ

• การสังเกตลักษณะทางจุลชีววิทยา:
  สังเกตฝักที่มีลักษณะเฉพาะของ Salmonella (เช่น บน XLD agar ฝักสีแดงพร้อมจุดสีดำตรงกลาง)

6. การยืนยันตัวตนของ Salmonella

เนื่องจากแบคทีเรียชนิดอื่นบางชนิดอาจสร้างฝักที่มีลักษณะคล้ายกันกับ Salmonella จึงจำเป็นต้องทำการยืนยันฝักที่น่าสงสัยโดยใช้วิธีดังต่อไปนี้:

• การทดสอบชีวเคมี (Biochemical Tests):

  • Triple Sugar Iron (TSI) Agar: สังเกตสไล้ที่เป็นด่าง (alkaline) พร้อมส่วนท้องที่เป็นกรด (acidic) และการผลิตไฮโดรเจนซัลไฟด์ (H₂S) ซึ่งทำให้เกิดการเปลี่ยนสีเป็นสีดำ
  • การทดสอบ Urease: Salmonella มักให้ผลเป็นลบ
  • การทดสอบความเคลื่อนไหว (Motility Test): ส่วนใหญ่ Salmonella มีความสามารถในการเคลื่อนไหว