Pseudomonas aeruginosa Counting Service

ขั้นตอนการนับ Pseudomonas aeruginosa

วัสดุและอุปกรณ์

• ตัวอย่าง: เช่น น้ำ, สิ่งแวดล้อม หรือ ตัวอย่างทางคลินิก
• ภาชนะและปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
• น้ำเจือจางที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (เช่น น้ำเพปโตน 0.1% หรือ น้ำเกลือที่ผ่านการฆ่าเชื้อ)
• ชุดกรองแบบเมมเบรน (Membrane filtration apparatus)
• แผ่นกรองเมมเบรนผ่านการฆ่าเชื้อ ขนาดรู 0.45 µm
• จานอาการคัดเลือก: โดยทั่วไปจะใช้จานอาการ cetrimide agar (หรือสื่อคัดเลือกอื่นๆ เช่น Pseudomonas CN agar)
• เครื่องบ่ม (Incubator): ตั้งอุณหภูมิที่ 35–37°C
• คีม (Forceps): ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ สำหรับจัดการแผ่นกรอง
• ถุงมือใช้แล้วทิ้งและเสื้อคลุมห้องแล็บ: เพื่อความปลอดภัยส่วนบุคคล
• เครื่องนับกลุ่มเชื้อ (Colony counter): แบบแมนนวลหรืออัตโนมัติ (ถ้ามี)

ขั้นตอนการปฏิบัติ

1. การเตรียมตัวอย่างและการเจือจาง

   • ก. ทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียว (Homogenize the Sample) (ถ้าจำเป็น):
     หากคุณทำงานกับตัวอย่างที่มีเมทริกซ์ซับซ้อน (เช่น อาหารหรือดิน) ให้ทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวในน้ำเกลือที่ผ่านการฆ่าเชื้อหรือบัฟเฟอร์
   • ข. เตรียมการเจือจางแบบต่อเนื่อง (Prepare Serial Dilutions):
     เพื่อให้ได้จำนวนกลุ่มเชื้อที่เหมาะสมกับการนับ ให้ทำการเจือจางแบบต่อเนื่อง (เช่น 10^–1, 10^–2, 10^–3 ฯลฯ) โดยใช้น้ำเจือจางที่ผ่านการฆ่าเชื้อ สำหรับตัวอย่างน้ำที่คาดว่ามีจำนวนแบคทีเรียต่ำ คุณอาจกรองปริมาณทั้งหมด (เช่น 100 mL) โดยตรงโดยไม่ต้องเจือจาง

2. การกรองด้วยเมมเบรน (Membrane Filtration)

   • ก. การประกอบอุปกรณ์กรอง:
     ตั้งค่าระบบกรองแบบเมมเบรนที่ผ่านการฆ่าเชื้อในบริเวณที่สะอาด (ควรอยู่ในตู้บำบัดความปลอดภัยชีวภาพหากทำงานกับเชื้อโรคทางคลินิกหรือสิ่งแวดล้อม)
   • ข. การกรองตัวอย่าง:
     กรองตัวอย่างในปริมาณที่วัดได้ (เช่น 100 mL หรือส่วนย่อยจากการเจือจาง) ผ่านแผ่นกรองเมมเบรนผ่านการฆ่าเชื้อที่มีรูขนาด 0.45 µm หากใช้การเจือจาง ให้บันทึกปริมาณที่กรองในแต่ละระดับการเจือจาง
   • ค. การย้ายแผ่นกรอง:
     โดยใช้คีมที่ผ่านการฆ่าเชื้อ ให้ย้ายแผ่นกรองไปวางบนพื้นผิวของจานอาการ cetrimide agar อย่างระมัดระวัง ตรวจสอบให้แน่ใจว่าแผ่นกรองวางอยู่ราบกับพื้นผิวของอาการ

3. การบ่ม (Incubation)

   • ก. บ่มจานอาการ:
     นำจานอาการที่เตรียมไว้ไปใส่ในเครื่องบ่มที่ตั้งอุณหภูมิที่ 35–37°C
   • ข. เวลาในการบ่ม:
     บ่มจานอาการเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมง P. aeruginosa มักจะผลิตกลุ่มเชื้อที่มีลักษณะเฉพาะ (มักมีสีเขียวอมฟ้าจากการผลิต pyocyanin) ภายในช่วงเวลานี้

4. การระบุและการนับกลุ่มเชื้อ (Colony Identification and Counting)

   • ก. ระบุกลุ่มเชื้อ:
     หลังจากการบ่ม ตรวจสอบจานอาการเพื่อหากลุ่มเชื้อที่มีลักษณะเฉพาะของ P. aeruginosa (เช่น กลุ่มเชื้อที่มีลักษณะหยาบ มีสี หรือบางครั้งมีกลิ่นผลไม้) เนื่องจากจานอาการ cetrimide เป็นสื่อคัดเลือก กลุ่มเชื้อส่วนใหญ่ควรเป็น P. aeruginosa แต่ในบางกรณีอาจจำเป็นต้องทำการทดสอบยืนยัน (เช่น ทดสอบ oxidase, การผลิตสี, การย้อมแกรม) ตามข้อกำหนดด้านการกำกับดูแล
   • ข. นับกลุ่มเชื้อ:
     เลือกจานอาการจากระดับการเจือจางที่ให้จำนวนกลุ่มเชื้อระหว่าง 30–300 กลุ่ม (ถ้าเป็นไปได้) เพื่อความแม่นยำในการนับ จากนั้นนับกลุ่มเชื้อแต่ละกลุ่ม (ไม่ว่าจะนับด้วยตาเปล่าหรือใช้เครื่องนับอัตโนมัติ)